Прозерин-Дарница применяют при миастении, двигательных нарушениях после травм мозга, параличах, в восстановительном периоде после перенесенных менингита, полиомиелита, энцефалита и других нейроинфекций, при невритах, для предупреждения и лечения атонии кишечника и мочевого пузыря, иногда - при слабости родовой деятельности. В глазной практике Прозерин-Дарница назначают при атрофии зрительного нерва, реже - для сужения зрачка и понижения внутриглазного давления при открытоугольной форме глаукомы.
В качестве антидота миорелаксантов препарат назначают при мышечной слабости и угнетении дыхания по окончанию анестезии с применением антидеполяризующих курареподобных препаратов, а также при применении деполяризующих миорелаксантов (дитилин) , если последние начинают действовать по типу антидеполяризующих ("двойной блок").
Прозерин назначают для восстановления нервно-мышечной проводимости.