Каким образом определяется EOF (конец файла)?

wav-файл - не текстовый, и обрабатывать его надо не как текстовый. Возможно, ты его обрабатываешь как текстовый - для текстового символ с кодом #26 считается символом конца файла, для нетекстовых - нет.
Если в wav-файле попадется код #26, то при обработке файла как текстового он будет считаться концом файла. Надо обрабатывать файл как бинарный.

кусочек кода-то покажи, который "неверно" определяет.
и, кстати, код - на pastebin.com

Пусть на диске есть некоторый текстовый файл. Нужно в диалоговое окно вывести содержимое этого файла. Решение задачи довольно очевидно: надо открыть файл, прочитать первую строку, затем вторую, третью и т. д. до тех пор, пока не будет достигнут конец файла. Но как определить, что прочитана последняя строка, достигнут конец файла? Для определения конца файла можно воспользоваться функцией EOF (End Of File — конец файла) .

У функции EOF один параметр — файловая переменная. Значение функции EOF равно False, если прочитанный элемент данных не является последним в файле, т. е. возможно дальнейшее чтение. Если прочитанный элемент данных является последним, то значение EOF равно True.

Значение функции EOF можно проверить сразу после открытия файла. Если при этом оно окажется равным True, то это значит, что файл не содержит ни одного элемента данных, т. е. является пустым (размер такого файла равен нулю).