Структура активного центра определяет специфичность действия ферментов. Большинство ферментов высокоспецифично как к природе, так и к пути превращения субстрата.
Ферменты могут различаться по субстратной специфичности и обладать абсолютной специфичностью, т. е. иметь только один субстрат и не взаимодействовать даже с очень близкими по строению молекулами (например, уреаза ускоряет гидролиз мочевины, но не действует на тиомочевину) , или даже стереоспецифичностью (когда фермент взаимодействует с определенным оптическим и геометрическим изомером) .
Некоторые ферменты проявляют более широкую специфичность (групповая или относительная специфичность) и взаимодействуют со многими веществами, имеющими похожую структуру (протеазы ускоряют гидролиз пептидных связей в белках, липазы ускоряют расщепление эфирных связей в жирах) .